稳转株构建

1. 稳转株构建的目的：

①持续表达特定的蛋白质，用于功能研究或蛋白生产。

②建立细胞模型，用于疾病机制研究或药物筛选。

③生产重组蛋白或抗体。

2. 常用的稳转株构建方法：

①病毒载体介导的基因转移：

逆转录病毒：将目的基因插入逆转录病毒载体，通过病毒感染将基因整合到宿主细胞基因组中。

慢病毒：类似于逆转录病毒，但能感染非分裂细胞，转染效率较高。

腺病毒：通常不整合到宿主基因组，但能高效转染多种细胞类型。

②非病毒载体介导的基因转移：

质粒DNA转染：使用电穿孔、脂质体介导等方法将质粒DNA直接转入细胞。

基因枪：利用高速粒子将DNA直接打入细胞核。

③CRISPR/Cas9技术：

通过设计特定的sgRNA（单链引导RNA）和Cas9蛋白，实现基因组的精确编辑和插入。

3. 稳转株构建的基本步骤：

①选择目的基因：确定需要插入的基因片段，并设计合适的表达载体。

②构建表达载体：将目的基因克隆到适当的表达载体中，如质粒、病毒载体等。

③转染细胞：使用适当的转染方法将表达载体导入目标细胞。

④筛选稳转细胞：

抗生素筛选：如果载体含有抗性基因，可以使用相应的抗生素进行筛选。

荧光筛选：如果载体含有荧光蛋白基因，可以通过荧光显微镜筛选表达荧光的细胞。

功能性筛选：根据目的基因的功能进行筛选，如抗体的特异性结合能力。

⑤克隆和扩增：挑选单个稳转细胞克隆并进行扩增培养。

⑥验证：

RT-PCR：检测目的基因的转录水平。

Western blot：检测目的蛋白的表达。

功能测试：验证目的蛋白的功能。

4. 注意事项：

①选择适合宿主细胞和目的基因的载体和转染方法。

②确保转染效率和稳转细胞株的稳定性。

③进行充分的筛选和验证，确保获得单克隆稳转细胞株。

稳转株构建是生物医学研究中的一项基本技术，广泛应用于基础研究、药物开发、生物制品生产等领域。